PERANAN STERILISASI

PENDAHULUAN

Hadioetomo (1985) merngatakan bahwa sterilisasi dapat dilakukan dengan berbagai cara yaitu panas, penyaringan, radiasi, dan penambahan bahan kimia. Sedangkan sterilisasi dengan cara panas dapat dilakukan dengan panas basah, panas kering, pemanasan bertahap dan perebusan. Pemanasan basah adalah sterilisasi panas yang digunakan bersama-sama dengan uap air. Pemanasan basah biasanya dilakukan didalam autoklaf atau aterilisator uap yang mudah diangkat dengan menggunakan uap air jenuh bertekanan pada suhu 121⁰C selama 15 menit. Menurut  Fardiaz (1992) cara pemanasan basah dapat membunuh jasad renik atau mikroorganisme terutama karena panas basah dapat menyebabkan denaturasi protein, termasuk enzim-enzim didalam sel. Perebusan adalah pemanasan didalam air mendidih atau uap air pada suhu 100⁰C selama beberapa menit. Pada suhu ini sel vegetatif dimatikan, sedang spora belum dapat dihilangkan                           (Lay dan Hastowo, 1992).

Pengamatan Dalam pembuatan PDA ini akan menghasilkan media yang akan digunakan sebagai media biakan bakteri dan jamur. Media PDA pada saat masih panas akan berbentuk cairan yang kental kemudian setelah dingin akan menjadi padatan. Media PDA (Potato Dextrosa agar) merupakan medium semi sintetik. Media merupakan tempat dimana tejadi perkembangan organisme. Organisme menyerap karbohidrat dari kaldu kentang dan gula serta dari agar yang telah bercampur. Hal inilah yang menyebabkan mengapa kentang harus di potong dadu, agar karbohidrat di kentang dapat keluar dan menyatu dengan air sehingga menjadi kaldu. Semakin kecil permukaan, maka semakin besar daya osmosisnya. Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu substrat yang disebut medium. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroorganisme tersebut harus sesuai susunanya dengan kebutuhan jenis-jenis mikroorganisme yang bersangkutan. Penggunaan kentang dalam pembuatan media karena kentang kaya akan karbohidrat yang sangat diperlukan oleh suatu mikroorganisme. Dalam pembuatan PDA ini biasa digunakan Dextrosa, namun dextros ini dapat digantikan dengan gula pasir biasa (Pelczar dan Chan, 1986).

Sterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang ada, sehingga jika ditumbuhkan di dalam suatu medium tidak ada lagi jasad renik yang dapat berkembang biak. Sterilisasi harus dapat membunuh jasad renik yang paling tahan panas yaitu spora bakteri. Adanya pertumbuhan mikroorganisme menunjukkan bahwa pertumbuhan bakteri masih berlangsung dan tidak sempurnanya proses sterilisasi. Jika sterilisasi berlangsung sempurna, maka spora bakteri yang merupakan bentuk paling resisten dari kehidupan mikrobia akan diluluhkan (Lay dan Hastowo, 1992).

Sterilisasi dengan bahan kimia digunakan alkohol 70 %. Menurut Gupte (1990), etil alkohol sangan efektif pada kadar 70 % daripada 100 % dan ini tidak membunuh spora. Sterilisasi dengan alkohol dilakukan pada proses pembuatan kultur stok dan teknik isolasi. Alkohol 70 % disemprotkan pada tangan praktikan dan alat-alat seperti makropipet dan mikropipet. Menurut Volk dan Wheeler (1988), alkohol bila digunakan pada kulit kontaknya terlalu pendek untuk menimbulkan banyak efek germisida dan alkohol segera menguap karena sifatnya mudah menguap. Namun alkohol dapat menyingkirkan minyak, partikel debu, dan bakteri.

Maksud dari media PDA di sini sebenarnya PSA. PDA kepanjangan dari Potato Dextose Agar yang terdiri dari ekstrak kentang, gula golongan dektrosa, dan agar. Sedangkan PSA terdiri dari gula pasir yang biasa kita konsumsi. PDA biasa dijual di toko kimia dalam bentuk bubuk siap pakai, harganya cukup mahal dan blia dibandingkan PSA tentu jauh terpaut. PDA biasa dipakai untuk penelitian mikrobiologi yang membutuhkan ketelitian dan kemurnian tinggi sedangkan PSA bersifat teknis di “lab lapang”. Bahan yang digunakan yaitu: kentang 200 gram, agar 7 gram, gula pasir 20 gram dan air 1 liter. Alat yang digunakan: kompor, panci, autoklaf, erlenmayer, gelas ukur,aluminium foil, pengaduk, plastik wrapping, kapas, petri dish/tabung vial.

            Menurut Rachmatullah cara pembuatan media PDA adalah:

1. Kentang dikupas, dicuci dan diiris dadu 1 x 1 cm

2. Rebus kentang dengan air 750 ml selama 20 menit

3. Pisahkan kentangnya dan ambil airnya (ekstrak)

4. Tambahkan gula, agar dan air dalam ekstrak kentang hingga 1 liter

5. Rebus kembali hingga mendidih. Jangan terlalu lama mendidihkannya, tepat ketika mendidih saja.

6. Tuangkan ekstrak tersebut ke dalam erlenmayer atau langsung ke tabung vial.

7. Sumbat erlenmayer dengan kapas dan ditutup almunium foil. Tabung vial cukup ditutup dan balut dengan plastik wrapping.

8. Sterilisasi dengan autoclaf selama 10 menit.

9. Setelah selesai, PSA pada erlenmayer (dalam keadaan panas, karena kalau dingin akan membeku) tuang tipis ke petri dish dalam laminar air flow cabinet. Sedangkan PSA dalam tabung vial letakkan miring hingga agar mengeras.

10. Celah pada tutup petri dish lapisi dengan plastik wrapping agar tidak ada celah dan menyebabkan kontaminasi.

11. Setelah PSA membeku, media sudah dapat digunakan

Alat yang digunakan untuk kultur jaringan yang diterapkan pada jaringan tanaman dalam keadaan yang aseptik. Semua material yang digunakan bebas dari mikroba di laboratorim. Prinsip-prinsip sterilisasi yang digunakan ada tiga tipe, yaitu: (1) dry heat, (2) wet heat, dan (3) filter sterilisasi (Ramawat, 2000).

Sterilisasi media kultur dapat dilakukan dengan autoklaf. Media yang akan di sterilisasi mula-mula dimasukkan ke dalam botol atau erlenmeyer bersih. Selanjutnya botol atau erlenmeyer yang telah bersih, media tersebut disusun rapi dalam autoclaf dan siap untuk disterilisasikan                                         (Isnansetyo dan Kurniastuty, 1995).

Perlu diketahui sumber kontaminasi juga sangat mempengaruhi hal tersebut. Dalam satu jenis bentuk ketahanan terhadap panas pun berbeda. Temperatur 160ºC dengan waktu 40-60 menit adalah pilihan yang paling baik. Seandainya kontaminasi terjadi, maka disarankan semua peralatan dan botol sterilisasi pada suhu 160ºC-180ºC. Perlu digaris bawahi disini bahwa upaya keras mengatasi kontaminasi organism adalah merupakan hal yang sangat penting pada kultur jaringan semua media botol, kultur dan alat-alat yang digunakan untuk menangkap jaringan harus diusahakan sama steril sebagaimana bahan tanaman yang digunakan itu untuk mencegah terjadinya hal itu, maka tempat dimana kegiatan kultur jaringan dilakukan harus disebabkan dari mikroorganisme dan patogen (Santoso dan Fatimah, 2005).

METODELOGI

Pembuatan Sterilisasi Bahan Dan Media PDA

Sterilisasi alat

1.       Dicuci alat yang akan digunakan hingga bersih

2.      Dikeringkan dengan tissue hingga benar-benar bersih dan kering

3.      Dibungkus alat dengan Koran

4.      Dimasukkan pada autoklaf dan dipanaskan selama lima belas menit dengan 1,5 atm

5.      Setelah petunjuk waktu mencapai 90 derajat maka angkat autiklaf dari kompor dan buka autoklapnya

Media PDA

6.      Disiapkan alat dan bahan

7.      Ditimbang kentang seberat 250 gr, dikupas, dan dipotong dadu

8.      Direbus dan setelah direbus diperas dengan kain

9.      Air perasan kentang dicampur dengan agar dan air

10.  Dipanaskan campuran tadi sehingga matang

11.  Setelah matang maka dimasukkan ke gelas kimia dan ditutup dengan tutup yang rapat

HASIL DAN PEMBAHASAN

Berdasarkan praktikum yang dilakukan media PDA yang didapatkan media PDA yang digunakan media yang beku. Hal yang perlu dilakaukan adalah menjaga kesterilan alat dan praktikan. Karena bila tidak steril, maka akan mempengaruhi hasilnya.

Dari hasil percobaan yang telah dilakukan diketahui bahwa media harus steril sehingga sesuai dan mendukung untuk perkembangan dan pertumbuhan eksplan tersebut. Semua media yang digunakan harus bebas dari mikroba dan sesuai dengan prinsip-prinsip sterilisasi yang digunakan yaitu: heat, wet heat dan filter sterilisasi. Hal ini sesuai dengan pernyataan Ramawat (2000) yang menyatkana bahwa jaringan tanaman  harus aseptik dengan prinsip-prinsip sterilisasi yang digunakan dibagi tiga tipe yaitu dengan heat, wet heat dan filter sterilisasi.

Dari hasil percobaan yang telah dilakukan diketahui bahwa eksplan bebas dari kontaminasi. Ini bertujuan agar tanaman yang digunakan sebagai eksplan tidak terkontaminasi oleh bakteri, karena bakteri dapat menyebabkan gangguan pada eksplan sehingga eksplan akan terganggu pada saat proses kultur jaringan. Hal ini sesuai dengan pernyataan  Santoso dan Fatimah (2005) yang menyatakan bahwa temperatur 160ºC dengan waktu 40-60 menit adalah pilihan yang paling baik. Karena bakteri dan mikroba lainnya dapat mati pada suhu di atas 100ºC.

DAFTAR PUSTAKA

Rachmatullah. Pembuatan Media PDA. http://bisnisjamur.wordpress.com.pembuatan-media-pda/

Pelczar, M. J. dan E. C. S. Chan. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. UI Press, Jakarta.

Lay, B. W. dan Hastowo. 1982.Mikrobiologi. Rajawali Press Jakarta.

Ramawat, K. O., 2000. Plant Biotechnology. Company Ltn. Ram Nagar. New Delhi.

Isnansetyo dan Kurniastuty,1995. Teknik Kultur Phytoplankton dan Zooplankton. Penebar Swadaya. Jakarta.